1结果与分析

  1.1 SDS-PAGE电泳
  4种花穗型裘皮的8份样品经蛋白质定量(BCA法,上样量为20μg)后，用SDS-PAGE电泳进行分离，最终获得的蛋白质条带(图1)，其平行度较好，条带较均一。
  1.2蛋白鉴定及其整体分布
  4种花穗裘皮样品经i TRAQ技术中的强阳离子交换柱分离，获得8组肽，经MS仪器分析，结果经Mascot查库，之后以Peptide FDR≤0.01为参照筛选过滤。结果有12 988个肽段(Peptide)被鉴定出，得到共计2 886个蛋白质组(Protein group)。以其相对分子质量、肽段数量及肽段序列覆盖率为依据对鉴定出的所有蛋内质进行统计，结果显示利用i TRAQ技术鉴定出的不同花穗裘皮样品中的蛋白，其中分子量在20～80 k D(A)之间的蛋白质数量较多，包含5个以内(B)的肽段的蛋白数量居多，蛋白覆盖率则大多集中于0%～20%之间(C)(图2)。
  图1 样品SDS-PAGE电泳
  
  Figure 1 Sample SDS-PAGE electrophoresis
  注:A1,A2:串子花型;B1,B2:软大花型;C1,C2:绿豆丝型;D1,D2:其它不规则型
  1.3各组显著性差异蛋白定量分析
  分别统计软大花型(B)与串子花型(A)、绿豆丝型(C)与串子花型(A)、其它不规则型(D)与串子花型(A)3个比对组得到的差异蛋白数量，对其进行分析，并定义其中ratio>1.3且p<0.05的蛋白为上调的蛋白，符合ratio<0.77且p<0.05的蛋白为下调的蛋白，分析各比较组的差异蛋白具体统计结果(表1)。
  依照各比较组筛选出的差异蛋白的数目，除未命名蛋白外，列出各比较组已鉴定出的存在显著差异的蛋白，得到其统计结果(表2)。
  统计分析3组经对比得到的差异蛋白，发现共有56个差异蛋白共同存在于B VS A与C VS A组中，其中上调蛋白21个，下调蛋白35个；而有46个相同的差异蛋白同时存在于B VS A与D VS A两组中，其中上调蛋白数19个，下调蛋白数27个；有59个相同的差异蛋白存在于C VS A与D VS A两组中，属于上调蛋白的22个，属于下调蛋白的37个；并且有36个相同的差异蛋白同时存在于B VS A、C VS A、D VS A组中，其中上调蛋白数为13个，下调蛋白数为23个，得到统计结果(图3)。所列出的差异蛋白主要是促甲状腺激素释放激素降解酶、细胞周期蛋白依赖性激酶5、非特异性丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶等蛋白酶类(表2)。
  1.4 GO分析
  3个比较组得到的差异蛋经过GO(Gene ontology)分析，结果在B VS A组的差异蛋白中发现其所涉及到的分子功能共有11种，生物学过程与细胞组成分别为22种和16种(图4A)；在C VS A组中发现的差异蛋白共涉及到分子功能12种，生物学过程22种，细胞组成15种(图4B);D VS A组中涉及到的分子功能共7种，生物学过程共22种，细胞组成共11种(图4C)。本试验检测出的3个比较组的差异蛋白主要涉及到催化、转运蛋白、抗氧化、分子功能调节剂等众多重要分子功能；涉及到生物的生长、生殖、代谢及免疫系统等一系列重要生物学过程；涉及到大分子复合物、细胞连接、细胞器、细胞外基质等细胞组成。
  图2 i TRAQ鉴定蛋白的总概况
  
  Figure 2 i TRAQ to identify the total protein profiles
  注:A:鉴定蛋白的质量分布;B:蛋白所含肽段的数量分布;C:肽段的序列覆盖度
  图3 各比对组差异蛋白分析
  
  Figure 3 Analysis of each match differentially expressed proteins
  1.5 KEGG分析
  对三比较组得到的差异蛋白进行KEGG生物通路富集分析，按p值分析各组的KEGG通路，由左至右p值增大，以p<0.05与p<0.01对其进行分类(图5),B VS A组中的差异蛋白涉及碳代谢、VEGF(Vascular endothelial growth factor)信号通路、丙酮酸代谢、花生四烯酸代谢、NOD样受体信号通路、FcεRI信号通路等共计14条通路(图5A)。C VS A组中比对得到的差异蛋白涉及丁酸代谢、维生素B6代谢、各种氨基酸代谢与降解及脂肪酸的代谢与降解等共计13条具体代谢通路(图5B)。在D VS A比对组中得到的差异蛋白涉及丙酸酯代谢、氨基酸代谢及降解、脂肪酸代谢及降解、芳香化合物的降解等共计21条代谢通路(图5C)。
  表1 差异蛋白统计
  
  表2 各比对组差异表达蛋白
  
  
  

  2讨论

  2.1 KAP3
  羊毛纤维几乎全部由蛋白质组成，主要组成成分是角蛋白与角蛋白相关蛋白(keratin-associated proteins,KAPs)，而KAPs则通过与角蛋白的相互作用影响毛纤维的机械性能(Plowman et al.,2015)。以毛纤维中所含半胱氨酸或甘氨酸与酪氨酸残基的比例为依据，人为地将KAPs又分为高硫蛋白(high-sulphur proteins,HSPs)、超高硫蛋白(ultrahigh-sulphur proteins,UHSPs)和高甘氨酸-酪氨酸(high-glycine-tyrosine proteins,HGTPs)蛋白(Rogers,2006)。有研究发现不同KAPs基因与羊毛绒品质具有一定的关联性(高建军等,2014)，这一观点与之前研究发现的细毛羊毛纤维中KAPs中的HSPs基因与毛纤维细度有着极大的关联(刘桂芬等,2007)相吻合。KAP3属于HSPs关联蛋白家族的一种，其中还包括KAP1和KAP2两种蛋白(Plowman et al.,2009)。已有相关研究发现KAP3.2基因与藏系绵羊毛长和产毛量性状存在相关性，并可作为这两个性状的分子标记(王志有等,2011)。有研究者利用RT-PCR技术研究藏绵羊KAP3.2基因的结构与功能，结果发现该基因在皮肤组织的表达存在特异性，对羊毛性状具有重要影响(杨珂伟等,2014)，而且KAP3.2基因在新吉毛羊超细型中的表达量极显著地高于其在新吉细型细毛羊中的表达量，可能影响毛纤维机制表达的代谢(刘春洁等,2015)。研究发现KAP3.3在羊毛纤维皮质层表达(Plowman et al.,2009)，进一步研究发现KAP3.3基因以组织特异性方式在羊皮肤毛囊中高度表达(Zhao et al.,2016)。本试验中KAP3是在C VS A对比组中发现的差异蛋白，且为下调蛋白，较绿豆丝型裘皮而言，串子花型裘皮中的KAP3高度表达，故而KAP3可能在滩羊串子花型毛股结构的形成过程中起重要作用。
  2.2 KAP6
  H GTPs家族包括KAP6、KAP7和KAP8等蛋白，在毛纤维的主要结构及机械性能方面扮演着重要的角色(Liu et al.,2014)。KAP6在羊毛纤维中的表达量会对毛纤维直径产生一定的影响(Cockett et al.,2001)。已有研究显示绵羊羊毛纤维直径的变化受到了KAP6.1基因变化的影响，并且在KAP6.1基因的57 bp片段缺失后，粗羊毛纤维直径的相关特性会发生极大变化(Zhou et al.,2015)。有研究者用PCR-SSCP方法对绒山羊KAP6.3基因编码区和3'-非翻译区进行多态性扫描，并分析其变异与绒山羊绒毛性状的关系，结果发现绒毛的长度、细度、产绒量均受KAP6.3不同SNPs位点的影响(刘海英,2007)。之后有人用同样的方法研究了高原型藏山羊产绒性状与KAP6.1和KAP6.2基因位点间的关系，结果显示KAP6.1主要影响产绒量性状，而KAP6.2基因与藏山羊的绒毛长度、细度等存在更大地相关性(王杰等,2010)，并于2016年，有研究者发现了羊KAP6.4和KAP6.5这两个新的基因，进一步完善了KAP6基因家族(Zhou et al.,2016)。在本试验中KAP6同样是在C VS A对比组中发现的差异蛋白，其ratio<0.77，故较KAP6在绿豆丝型裘皮中的表达而言，KAP6在串子花型裘皮中属于高度表达，从KAP6在滩羊不同花穗型裘皮的表达量可推测，KAP6在滩羊串子花型裘皮中高度表达与其串子花型毛股形成有着紧密的联系。
  图4 差异蛋白GO注释
  
  Figure 4 Differential protein GO annotation
  注:A:软大花型/串子花型;B:绿豆丝型/串子花型;C:其它不规则型/串子花型
  图5 差异蛋白KEGG富集分析
  
  Figure 5 Differential protein KEGG enrichment analysis
  注:A:软大花型/串子花型;B:绿豆丝型/串子花型;C:其它不规则型/串子花型
  2.3膜联蛋白
  膜联蛋白是一类磷脂结合蛋白，它的表达受到钙离子的调控。作为膜联蛋白多基因家族成员之一膜联蛋白A2则广泛表达于多细胞生物体内，并在多种类型的细胞中均有存在，起初发现于Rous肉瘤病毒转化的鸡胚胎成纤维细胞中(Hastie et al.,2008)。研究表明，膜联蛋白A2与多种炎症机制的反应有关，而且参与细胞粘附及胞吐等过程，并且在宫颈组织中的过度表达与宫颈癌的发生发展关系密切(赵丽萍和陆晓媛,2010)。有研究表明，膜联蛋白A2与人类多种心血管、肿瘤及病毒感染疾病有关，当膜联蛋白A2的表达量较高时，纤溶酶的表达量增多，加快细胞外基质的降解，对血管再生有一定的积极作用(聂纪芹等,2012;Yi et al.,2016)，而且李璟波等(2015)还发现膜联蛋白A2在非小细胞肺癌的诊断中具有一定的意义。本试验中，膜联蛋白相对而言在软大花型中的表达量较高，为上调蛋白，通过生物信息分析，发现其主要涉及到代谢过程的调节、营养水平反应的调节、对细胞外环境刺激的应答反应等生物学过程，并且与细胞的多种组成成分密不可分，涉及到阴阳离子结合、钙依赖性磷脂结合等系列分子功能。因此可推测其与软大花型毛股的形成具有一定的关联。
  2.4 VEGF信号通路
  血管内皮生长因子(VEGF)是主要作用于血管内皮细胞的血管生成因子，与血管正常的生长、发育以及伤口愈合有着密切的关系，与血管肿瘤生长和转移等过程有关，是一种促进血管生成活性的功能性蛋白，目前发现的VEGF主要有胎盘生长因子与VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D等5个成员(Nash et al.,2006;Saito et al.,2007)。VEGF信号通路具有启动并调节胚胎血管的发育的作用(Aguago et al.,2002;姜怀志等,2010)。VEGF特异性作用于内皮细胞调控着血管新生，影响着血管的通透性，并与其它因子协同作用，促进血管内皮细胞增殖、迁移，诱导血管生长、形成及其相关蛋白酶的合成(Jalali et al.,2001;Wagatsuma,2007;姜怀志,2012)。VEGF对皮肤毛囊血管新生具有重要意义，调控着毛囊的周期性变化(姜怀志,2012)。已有研究发现VEGF可以促进毛囊发育,并影响毛囊直径(Araújo et al.,2011)。无独有偶，有研究者测定了辽宁绒山羊常年长绒和季节长绒两个品系皮肤毛囊中VEGF的相对表达量，发现辽宁绒山羊常年长绒型品系常年长绒可能与VEGF基因m R-NA的相对表达量常年维持在一个较高的水平有关(姚纪元等,2010)。之后又有人发现在胎儿期，绒山羊体内的VEGF与皮肤上微血管密度呈显著强的正相关(谷博等,2013)，这说明VEGF可增加毛囊的微血管密度，以利于毛囊发育。并且早期有研究已表明VEGF能维持毛囊超微结构的完整性，促进毛囊生长(Bruno et al.,2009)。本试验中对B VS A组的差异蛋白进行KEGG通路分析发现其涉及VEGF信号通路，在软大花型裘皮中涉及VEGF信号通路的差异蛋白有较高表达量，属于上调蛋白，故而可推测VEGF信号通路所涉及的差异蛋白在滩羊二毛期花穗形成过程中的高表达有利于产生更多的绒毛，形成软大花型毛股。

  3材料与方法

  3.1样品采集
  4种滩羊二毛期的不同花穗型裘皮样品均采集于宁夏盐池的滩羊选育场(图6)，取样部位为羊体侧肩胛骨后缘1 cm2处，每种花穗型裘皮的滩羊采2份样品，共8份，采集的样品经生理盐水处理，立即置于装有干冰的泡沫盒中，带至实验室，保存于超低温冰箱(-80℃)备用，得到样品信息(表3)。
  3.2实验仪器与试剂
  E PS601 600V电泳仪、AKTA Purifier 100纯化仪均由GE Healthcare提供；Q-Exactive质谱仪、纳升级液相色谱仪(型号:Easy n LC1000)均购于Thermo Finnigan；低温高速离心机，型号为Eppendorf 5430R;Eppendorf Concentrator plus真空离心浓缩仪；UV-2100型可见紫外分光光度计(尤尼柯WFZ)。
  图6 滩羊二毛期不同毛股花穗型
  
  Figure 6 Tan sheep er-mao different hairs spike type
  注:A:串子花型;B:软大花型;C:绿豆丝型;D:其它形态
  表3 样品信息
  
  SDS(161-0302,Bio-Rad),Urea(161-0731,Bio-rad),Trisbase(161-0719,Bio-rad),DTT(161-0404,Bio-rad),IAA(Bio-rad,163-2109),KH2PO4(10017618,国药)，NH4HCO3(Sigma,A6141);i TRAQ Reagent-8plex Multiplex Kit(AB,SCIEX),Acetonitrile,ACN(I59223-0123,Merck);C18Cartridge(66872-U,Sigma);5×上样缓冲液；SDT Buffer;UA Buffer;Dissolution Buffer(AB,SCIEX)。
  3.3样品的制备
  将不同类型的皮肤样品分别置于研钵中，加入适量液氮研磨至粉状，加入STD Buffer(150 mmol/L Tris-HCl,4%SDS,1 mmol/L DTT,p H=8.0)溶液600μL，匀浆，然后沸水浴5 min，用超声波破碎(80 W,每次超声8 s,间隔10 s,持续5 min)，置于沸水浴5 min,12 000 g离心持续15 min，提取上清液，进行BCA蛋白质定量。
  3.4 SDS-P AGE电泳
  在上述BCA法定量后的8份样品中各取20μg，加入5×上样缓冲液(体积比5∶1)，经5 min沸水水浴，10 min 14 000 g的高速离心后，提取上清液，用于进行12.5%的SDS-PAGE电泳(恒流:14 m A,持续90 min)，用考马斯亮蓝染色。
  3.5胰蛋白酶酶解
  各取200μg的裘皮样品，用胰蛋白酶酶解，具体步骤详见杨佐青等(2017)，得到酶解肽。
  3.6 i TRAQ标记
  参照OD280肽段定量的结果，分别取约80μg的4种不同毛股花穗型裘皮样品，共8份，依据i TRAQ试剂盒说明书进行标记，将标记后的各组肽段混合，得到样品标记信息(表4)。
  3.7毛细管高效液相色谱分析
  用Easy n LC液相系统分离上述标记的样品，具体方法参照“应用i TRAQ技术对滩羊裘皮差异表达蛋白的研究”一文(杨佐青等,2017)。
  表4 样品标记
  
  3.8质谱鉴定
  用Q-Exactive质谱仪对上述经色谱分离后的样品进行MS分析，具体分析模式参照杨佐青等(2017)。
  3.9质谱数据分析
  用Mascot2.2和Proteome Discoverer1.4(Thermo)软件对经质谱鉴定产生的原始数据进行查库(uniprot Ovis aries蛋白质库)鉴定和定量分析，以FDR≤0.01为蛋白鉴定的过滤参数，肽段报告离子峰强度值选用Proteome Discoverer软件进行定量分析。
  3.10差异蛋白分析
  以A1和A2两份样品的113和114两组通道平均值为参数，其余各通道标签与参数的比值即为各组蛋白质的i TRAQ比值。将鉴定出的蛋白质进行T检验与显著性分析(p value)确定出存在显著差异的蛋白。对得到的差异蛋白进行分析，当某一差异蛋白的丰度比在1.3以上或0.77以下，且其p<0.05时，则将该蛋白定义为不同样品间的显著差异蛋白。
  3.11生物信息学分析
  根据相似性原理，即序列相似的蛋白其功能也可能相似，将各比较组得到的差异蛋白与GO数据库以及KEGG pathway数据库进行对比，并对其进行GO注释和KEGG通路分析，最终将具有同源性的蛋白的注释信息分别转嫁到各自所对应的差异蛋白上，以研究不同花穗型皮肤样中存在表达差异的蛋白所起的生物学作用及其可能参与的机体代谢过程。